Les dispositifs microtechniques permettent de longues

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 5006 (2022) Citer cet article

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La dynamique et la connectivité des circuits neuronaux changent continuellement sur des échelles de temps allant de la milliseconde à la durée de vie d'un animal. Par conséquent, pour comprendre les réseaux biologiques, des méthodes peu invasives sont nécessaires pour les enregistrer à plusieurs reprises chez les animaux qui se comportent. Nous décrivons ici une suite de dispositifs qui permettent des enregistrements optiques à long terme du cordon nerveux ventral adulte de Drosophila melanogaster (VNC). Celles-ci consistent en des fenêtres transparentes numérotées pour remplacer l'exosquelette thoracique, des implants conformes pour déplacer les organes internes, un bras de précision pour faciliter l'implantation et une platine articulée pour attacher les mouches à plusieurs reprises. Pour valider et illustrer notre boîte à outils, nous (i) montrons un impact minimal sur le comportement et la survie des animaux, (ii) suivons la dégradation des terminaisons nerveuses mécanosensorielles des organes chordotonaux pendant des semaines après l'amputation de la jambe, et (iii) découvrons des vagues d'activité neurale ingestion de caféine. Ainsi, notre boîte à outils d'imagerie à long terme ouvre l'étude des adaptations des circuits prémoteurs et moteurs en réponse aux blessures, à l'ingestion de médicaments, au vieillissement, à l'apprentissage et à la maladie.

Les tissus neuronaux sont remarquablement plastiques, s'adaptant aux changements d'états internes et en réponse à une exposition répétée à des signaux environnementaux saillants. En neurosciences, les études physiologiques de phénomènes à longue échelle de temps, y compris la formation de la mémoire et la neurodégénérescence, se sont souvent appuyées sur la comparaison de données regroupées sur des animaux échantillonnés à plusieurs moments. Cependant, la quantification des différences entre les conditions avec cette approche souffre de la variabilité interindividuelle. Ainsi, des enregistrements longitudinaux du même animal seraient idéaux pour découvrir des changements adaptatifs dans la dynamique fonctionnelle et structurelle des circuits neuronaux. Des défis techniques importants doivent être surmontés pour effectuer des études à long terme sur des animaux individuels, y compris la minimisation des insultes expérimentales.

Avec l'avènement des enregistrements neuronaux basés sur la microscopie, notamment l'imagerie calcique à deux photons1, il est devenu possible d'enregistrer de manière chronique les circuits cérébraux in vivo de manière peu invasive en tirant parti des dispositifs chroniques. Par exemple, les technologies de fenêtre crânienne ont d'abord été développées pour étudier le néocortex2 de la souris et ont depuis été améliorées pour acquérir des champs de vision d'imagerie plus larges3 et plus profonds4, ainsi que des enregistrements de plus longue durée5. Comme pour les rongeurs, l'imagerie cérébrale peut également être réalisée chez la mouche adulte, Drosophila melanogaster6,7, un organisme modèle populaire qui est (i) génétiquement traitable, (ii) a un petit système nerveux avec beaucoup moins de neurones que les rongeurs, et ( iii) génère des comportements sociaux, de navigation et moteurs complexes8,9,10,11.

Des approches récentes ont permis des enregistrements chroniques à long terme de neurones dans le cerveau de la mouche12,13,14. Semblable à l'imagerie du néocortex des rongeurs avec une fenêtre crânienne15, le cerveau de la mouche peut être rendu optiquement accessible en enlevant la cuticule de la capsule céphalique et les tissus sous-jacents6. Pour effectuer une imagerie à long terme ou répétée, ce trou peut ensuite être recouvert de colle durcissable aux UV13, de silicone à deux composants16 ou de lamelles12 coupées manuellement. Cependant, les techniques et technologies utilisées pour effectuer une imagerie à long terme dans le cerveau des souris et des mouches ne conviennent pas pour enregistrer les circuits moteurs dans la moelle épinière des mammifères ou le cordon nerveux ventral des insectes (VNC). Comme la moelle épinière, qui est obscurcie par l'os vertébral, les muscles et la lame dorsale17, l'accès optique au VNC nécessite le retrait de plusieurs organes et tissus sus-jacents, notamment les muscles de vol, les corps gras, l'intestin et la trachée. Les chirurgies invasives de la moelle épinière permettent l'implantation d'une chambre18, ou d'une pince19. Cependant, la petite taille de la mouche limite l'utilisation de dispositifs implantables conventionnels, ce qui représente un défi important pour découvrir les principes généraux du contrôle moteur à travers l'étude du VNC expérimentalement traitable - un tissu nerveux grossièrement organisé comme la moelle épinière des mammifères20, et dont les principes de contrôle ressemblent à ceux trouvés chez les vertébrés21,22.

Nous avons récemment développé une approche de dissection qui donne un accès optique au VNC chez les animaux captifs, en retirant chirurgicalement et génétiquement - dans le cas des muscles de vol indirects - les tissus sus-jacents23. Cependant, cette technique est invasive, nécessitant la résection des organes thoraciques et laissant ouverte la cavité thoracique lors de l'imagerie. Cela exclut les enregistrements qui durent au-delà de quelques heures. Par conséquent, il a été impossible d'effectuer des mesures répétées des circuits prémoteurs et moteurs dans la même mouche pour faire la lumière sur la façon dont ces circuits s'adaptent au fil du temps. Les outils existants pour l'imagerie cérébrale à long terme sont insuffisants pour l'imagerie VNC à long terme. Contrairement à l'imagerie cérébrale, on ne peut pas coller13, ou découper manuellement des lamelles12 pour recouvrir le trou thoracique après dissection. Au lieu de cela, il faut une approche plus précise et reproductible qui garantit que l'hémolymphe ne fuit pas du thorax. De plus, pour obtenir un accès optique au VNC, il faut déplacer doucement mais fermement les grands organes et tissus thoraciques sus-jacents sans perturber leur fonction.

Ici, nous décrivons une suite de dispositifs microtechniques qui répondent à tous ces défis pour permettre des enregistrements à long terme et répétés de la Drosophila VNC pendant plus d'un mois. Ces appareils répondent aux défis uniques associés à l'étude de petits organismes modèles (la mouche mesure environ 2 à 3 mm de long) qui nécessitent une manipulation extrêmement douce. Plus précisément, nous avons conçu (i) un manipulateur ("bras") qui nous permet d'écarter et de maintenir temporairement en place les organes thoraciques, (ii) des implants flexibles qui éliminent le besoin d'enlever chirurgicalement les organes thoraciques pour obtenir un accès optique au VNC, (iii) une fenêtre transparente en polymère qui renferme la cavité thoracique et est numérotée pour permettre aux mouches individuelles de se distinguer les unes des autres à travers les séances d'imagerie, et (iv) une étape de remontage pour attacher doucement mais fermement les mouches pour des enregistrements répétés. Nous fournissons des descriptions détaillées de la façon de fabriquer et d'utiliser tous ces outils pour faciliter leur réplication et leur adoption par d'autres laboratoires.

Nous démontrons que les implants et les fenêtres ont un impact minimal sur la survie et la locomotion des animaux, et qu'ils permettent des enregistrements neuronaux sur au moins un mois. Ensuite, nous illustrons des cas d'utilisation de notre boîte à outils d'imagerie à long terme dans deux études de preuve de concept. Tout d'abord, nous mesurons longitudinalement la dégradation de l'innervation des neurones mécanosensoriels des membres du VNC pendant deux semaines après le retrait de la jambe. Deuxièmement, nous illustrons comment, en laissant les organes thoraciques intacts, on peut mesurer l'impact de l'ingestion de médicaments sur la dynamique de la population neuronale. Ainsi, notre boîte à outils d'imagerie thoracique à long terme permet l'étude répétée et longitudinale de la dynamique neurale structurelle et fonctionnelle dans les circuits prémoteurs et moteurs. Ces outils peuvent plus généralement être utilisés pour étudier d'autres tissus thoraciques, y compris les muscles de vol indirect, l'intestin et la trachée.

Nous avons développé des dispositifs microtechniques et des protocoles de micromanipulation associés qui permettent un accès optique au VNC de la mouche pendant plus d'un mois. Les mouches implantées ne présentent aucun déficit évident dans leur capacité à se nourrir, à marcher, à pondre ou à interagir avec les autres. (Fig. 1a et Film supplémentaire 1). L'accès optique repose sur deux éléments principaux : un implant compliant et transparent (Fig. 1b) et une fenêtre thoracique transparente (Fig. 1c). La fabrication des fenêtres doit être reproductible et elles doivent être suffisamment grandes pour sceller solidement l'ouverture thoracique afin d'éviter les fuites d'hémolymphe. Les solutions développées pour l'imagerie cérébrale à long terme, telles que le scellement avec de la colle durcissable aux UV13 ou un morceau de lamelle coupé manuellement12, ne répondent pas à ces défis. Nous avons conçu et microfabriqué une fenêtre personnalisée à l'aide d'un polymère biocompatible, le SU-8, par photolithographie (Fig. 1 supplémentaire). Comme les implants ne sont pas nécessaires pour l'imagerie cérébrale à long terme, ceux-ci ont dû être conçus de novo et sans s'inspirer des approches précédentes. Nos premiers implants étaient des structures rigides destinées à protéger les régions d'intérêt (ROI) d'imagerie VNC de l'occlusion par les tissus thoraciques (Fig. 2 supplémentaire, «itérations 1 et 2»). Des itérations ultérieures ont tenté de combiner des fenêtres thoraciques avec des piliers de protection (Fig. 2 supplémentaire, «itérations 3 et 4»). Cependant, ces deux prototypes initiaux ont donné des taux de survie prohibitifs. Nous avons réalisé une percée en adoptant une approche complètement différente : nous avons conçu des implants en forme de V compliants (à base de polymères) mécaniquement compressibles. Grâce à plusieurs itérations et tests, nous avons convergé sur la taille et l'angle spécifiques de ces implants, ce qui a entraîné un taux de survie post-implantation très élevé. Nous avons fabriqué ces implants en masse à l'aide de la lithographie douce, une technique basée sur le prototypage rapide et le moulage de répliques (Figs. 3 et 4 supplémentaires).

a Les mouches adultes implantées peuvent être élevées dans des environnements complexes. Un animal implanté --- voir fenêtre thoracique dorsale (flèche noire) --- interagit avec un animal non implanté. La barre d'échelle est de 0,5 mm. b Un implant transparent, mécaniquement conforme, microfabriqué à partir d'Ostemer 220. La barre d'échelle est de 50 μm. c Une fenêtre thoracique transparente numérotée microfabriquée en SU-8. La barre d'échelle est de 50 μm. d Pour l'implantation, un animal est monté, le thorax d'abord, dans un trou dans une cale en acier au cours d'une étape de dissection. e Une dissection en plusieurs étapes permet un accès optique à long terme au cordon nerveux ventral (VNC). gauche Un trou est coupé dans la cuticule thoracique dorsale, révélant le proventricule (jaune), la trachée (cyan) et la glande salivaire (magenta) recouvrant le cordon nerveux ventral (VNC, bleu foncé). Les muscles de vol indirect (IFM) ont été dégradés par l'expression tissu-spécifique de Reaper (Act88F:Rpr)23.Ensuite, à l'aide d'un bras manipulateur conçu sur mesure, les organes thoraciques sont déplacés, révélant le VNC. milieu Ensuite, l'implant est placé dans ce trou thoracique dans une configuration étroite et fermée mécaniquement. à droite Le bras est retiré et l'implant est libéré, ce qui provoque son ouverture et écarte mécaniquement les organes recouvrant la VNC. Enfin, une fenêtre transparente est scellée pour enfermer le trou thoracique. f Une étape de remontage nanoimprimée en 3D permet de monter et de démonter des animaux pour une imagerie répétée à deux photons. gauche Le mécanisme monolithique est actionné autour d'une charnière compliante. droite Exemple d'image d'un animal attaché à l'étape de remontage, vu de dessus. g Les animaux implantés attachés à l'étape de remontage sont placés sous un microscope à deux photons entouré d'un réseau de caméras. Cette configuration permet des enregistrements simultanés de l'activité neuronale et du comportement animal. L'encart montre une image de caméra superposée par des poses 2D basées sur l'apprentissage en profondeur estimées à l'aide de DeepFly3D25. h (rangée du haut) Le thorax dorsal d'un animal implanté, vu du microscope à dissection, et (rangée du bas) son VNC, visualisé à l'aide de la microscopie à deux photons. Cet animal exprime la GFP dans tout le système nerveux et est enregistré à gauche 3 dpi, au milieu 14 dpi et à droite 28 dpi. Les piles Z sont codées par couleur en profondeur (100 μm). La barre d'échelle est de 25 μm.

Pour utiliser ces outils, nous avons développé un protocole de manipulation illustré dans le film supplémentaire 2. En bref, nous montons d'abord les animaux sur une étape de dissection chirurgicale à l'aide de colle durcissable aux UV (Fig. 1d)23. Ensuite, nous avons découpé un trou de forme carrée dans la cuticule dorsale à l'aide d'une aiguille de seringue 30G (Fig. 1e - panneau de gauche). Les muscles de vol indirect (IFM) sont ensuite retirés pour créer une ouverture thoracique pour l'implant. Pour minimiser l'impact de la microchirurgie, nous travaillons avec des animaux exprimant la protéine induisant l'apoptose, Reaper, spécifiquement dans les IFM (Act88F:Rpr). L'expression de Reaper entraîne une dégradation rapide du tissu musculaire23, dont le reste peut facilement être retiré avec l'aiguille de la seringue. Cependant, cette lignée génétique n'est pas strictement requise pour utiliser ces outils. Après avoir exposé les tissus thoraciques, nous utilisons ensuite une fine aiguille de verre et une pince pour détacher unilatéralement les fibres trachéales qui relient l'intestin et la glande salivaire gauche. Nous avons conçu un bras de manipulation personnalisé (Fig. 5 supplémentaire) pour pousser les organes internes - intestin, glande salivaire et trachée - vers le côté droit de la cavité thoracique (Fig. 1e - panneau de gauche). Cela permet d'insérer l'implant à l'état fermé dans la cavité thoracique nouvellement accessible (Fig. 1e - panneau du milieu et Fig. 4 supplémentaire). Lors de la libération, l'implant s'ouvre progressivement en maintenant les organes contre la paroi thoracique après la rétraction du bras de manipulation (Fig. 1e - panneau de droite). Nous scellons la cavité thoracique exposée en collant une fenêtre transparente en polymère sur la cuticule (Fig. 1e - panneau de droite). Ces fenêtres ont des numéros uniques gravés sur leurs surfaces qui permettent d'identifier et de distinguer les animaux implantés. Nous pouvons ensuite détacher les animaux en retirant la colle durcissable aux UV qui maintient le scutellum au stade de la dissection, leur permettant de se comporter librement.

Pour faciliter l'attache répétée et douce des mouches implantées, nous avons imprimé une étape de remontage (Fig. 1f et Fig. 6 supplémentaire) en utilisant la polymérisation à deux photons24. Ce processus de fabrication a la précision requise pour fabriquer des éléments 3D qui maintiennent les animaux en place de manière fiable. Une fois montés, nous avons étudié les animaux à l'aide d'un système de microscope à deux photons entouré d'un réseau multi-caméras. Ce système permet des enregistrements simultanés de l'activité neuronale dans le VNC23 ainsi que le suivi des parties du corps en 3D sans marqueur25 (Fig. 1g). Dans la grande majorité des cas, notre protocole d'implantation a réussi. Rarement, les animaux implantés présentaient des mouvements spécifiques des tissus respiratoires ou digestifs qui pouvaient obstruer le VNC pendant l'imagerie (Fig. 7 supplémentaire). Une implantation réussie a permis un accès optique au VNC qui est resté largement inchangé pendant un mois. Cela a permis des études répétées de la structure (Fig. 1h et Film supplémentaire 3) et de la dynamique fonctionnelle des populations neuronales chez les mouches femelles (Film supplémentaire 4) et mâles (Film supplémentaire 5). Nos outils d'enregistrement à long terme pourraient également être appliqués à l'enregistrement de paires de neurones génétiquement identifiables. Nous illustrons cela par l'imagerie de l'activité d'une paire de neurones descendants DNa01 sur trois jours --- 1, 3 et 5 jours après l'implantation (dpi)). Cette activité est en corrélation avec le virage locomoteur23 (Fig. 8 supplémentaire et Film supplémentaire 6). Bien qu'ici nous nous sommes concentrés sur l'accès optique au neuromère conjonctif et prothoracique cervical (T1) du VNC (Fig. 1h), notre approche est générale, permettant la reconception et la microfabrication d'implants qui permettent l'imagerie d'autres régions du VNC. Comme preuve de concept, nous avons modifié un implant, permettant de retenir les tissus dans le thorax postérieur et d'accéder optiquement aux neuromères T2 et T3 (Fig. 9 supplémentaire).

Pour valider notre approche d'enregistrement à long terme, nous avons d'abord étudié l'impact potentiel de l'implantation sur la durée de vie. Plus précisément, nous avons mesuré la longévité de trois groupes d'animaux (n = 40 par groupe) : (i) les mouches qui n'ont pas été manipulées (« Intactes »), (ii) les animaux qui ont subi une anesthésie à froid, montés sur l'étape de dissection, et les ailes retrait ("Implantation fictive"), ou (iii) mouches qui ont subi la procédure d'implantation complète ("Implantation"). Pour cette expérience, 73 % des animaux implantés ont survécu plus de 4 h après la chirurgie. Parce que la procédure chirurgicale et d'implantation pour une seule mouche prend environ 40 min du début à la fin, le débit total - une combinaison de ce temps d'implantation et du taux de survie aiguë - était d'un animal implanté par 55 min. Parmi les mouches qui ont survécu plus de 4 h après l'implantation, nous avons observé une survie maximale allant jusqu'à 88 jours. Cependant, les mouches implantées présentaient une mortalité plus élevée que les animaux intacts dans les premiers jours suivant l'implantation (Fig. 2a). Notamment, les mouches implantées de manière fictive avaient une mortalité accrue de la même manière dans les premiers jours, ce qui suggère que la manipulation des animaux avant l'implantation, et non l'implantation elle-même, était responsable de l'augmentation de la mortalité. Nous avons obtenu des taux de survie similaires pour les mouches mâles implantées par rapport aux mouches mâles intactes examinées pendant 20 jours (Fig. 10a supplémentaire).

a Courbes de survie pour des animaux frères et sœurs génétiquement identiques qui ont été (i) non manipulés expérimentalement (vert, « intact »), (ii) attachés, anesthésiés au froid et dont les ailes ont été retirées (bleu, « implantation factice »), ou (iii) ) préparé pour l'imagerie à long terme par implantation et l'ajout d'une fenêtre thoracique (orange, "Implanté"). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. b Les comportements ont été comparés en analysant la dynamique de la marche arrière optogénétiquement activée dans une arène de forme carrée arrondie. La locomotion a été analysée et tracée par calcul, montrant la trajectoire initiale vers l'avant de l'animal (cyan) et la trajectoire de marche vers l'arrière évoquée optiquement (violet). c Vitesses de translation des animaux intacts (en haut), simulés implantés (au milieu) et implantés (en bas) pendant 30 s de comportement spontané, suivis de trois périodes de stimulation optogénétique de 3 s chacune (rose, 'Stim'). Ici, nous avons regroupé les données enregistrées à trois périodes sur un mois. Les tracés bruts (gris) et moyens (bleu) sont affichés. À partir de ces séries chronologiques, chaque événement de stimulation est un point de données à partir duquel nous avons calculé des statistiques récapitulatives (groupe intact, n = 286 événements ; groupe implanté simulé, n = 208 événements ; groupe implanté, n = 213 événements) y compris (d) le pente négative initiale de la vitesse de translation --- marche arrière --- lors de la stimulation optogénétique, (e) la distance de marche arrière parcourue sur toute la période de stimulation optogénétique et (f) la vitesse de translation négative maximale sur toute la période de stimulation optogénétique. Un astérisque (*) indique P < 0,05. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Ensuite, bien que l'implantation n'affecte pas considérablement la longévité, nous avons pensé que placer un objet microfabriqué dans le thorax pourrait avoir un impact négatif sur la marche, peut-être en raison de la perturbation de la musculature liée aux jambes, ou simplement de la charge supplémentaire. Il est difficile d'étudier cette possibilité car les mouches utilisent une variété d'allures diverses à différentes vitesses de marche et manœuvres26. Par conséquent, pour pouvoir effectuer une analyse quantitative de la marche, nous avons conduit la marche arrière stéréotypée par activation optogénétique du canal cationique photosensible, CsChrimson27 exprimé dans les neurones descendants de Moonwalker (MDN)28,29. Nous avons stimulé des animaux dans une arène construite sur mesure (Fig. 2b) à plusieurs reprises au cours d'un mois. Cela nous a permis de quantifier et de comparer les trajectoires de marche de mouches intactes, faussement implantées ou implantées. Nous avons d'abord enregistré des comportements spontanés pendant 30 s, puis avons émis trois flashs consécutifs de lumière orange à 590 nm pendant 3 s chacun (Fig. 2c, rose et Fig. 11a supplémentaire) avec un intervalle inter-stimulus de 10 s. Ces expériences ont été réalisées sur les mêmes animaux à trois périodes de temps sur un mois (1 à 3 jours après l'implantation (dpi), 14 à 16 dpi et 28 à 30 dpi). Lors de la stimulation optogénétique, nous avons observé que les animaux généraient une marche arrière rapide qui ralentissait progressivement et revenait rapidement à la ligne de base lorsque la lumière était éteinte (film supplémentaire 7). Au cours de toutes les sessions d'enregistrement, nous avons observé une petite différence significative dans l'accélération vers l'arrière initiale (Fig. 2d) entre le groupe intact et le groupe implanté fictivement (P = 0,044 Kruskal-Wallis avec test de Conover post-hoc) et entre le groupe 'intact' et le groupe « implanté » (P = 0,044). Cependant, aucune différence statistique n'a été observée dans les vitesses de translation des animaux intacts, implantés de manière factice et implantés en termes de distance de marche arrière totale parcourue (Fig. 2e) et de vitesse de marche arrière maximale (Fig. 2f). Des résultats similaires ont été obtenus lors de la comparaison de cohortes restreintes en fonction de l'âge. Plus précisément, nous n'avons pas observé de différence entre les groupes intacts et implantés dans l'accélération initiale vers l'arrière pour toute cohorte d'âge (1–3 dpi, 14–16 dpi ou 28–30 dpi). Les mouches intactes avaient une accélération vers l'arrière légèrement plus lente (cela peut être dû au contact entre les pattes et les ailes qui s'affaissaient chez les animaux exprimant Act88F:Rpr). Nous avons noté une différence significative entre les deux groupes de contrôle à 14–16 dpi (Fig. 11b, c supplémentaires) pour (i) la pente de réponse à la marche arrière (P = 0,009), (ii) la distance de marche arrière parcourue (P = 0,0008 ), et (iii) la vitesse de translation négative maximale (P = 0,003). La marche spontanée était également qualitativement inchangée chez les mouches mâles implantées par rapport aux mouches intactes (film supplémentaire 8). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que la locomotion n'est pas significativement affectée par l'implantation.

Les circuits neuronaux conservent une capacité de réarrangement structurel tout au long de l'âge adulte30,31. Cela permet des adaptations en réponse aux lésions du système nerveux32,33,34 et aux accidents vasculaires cérébraux35. De même, chez les mouches, les démarches locomotrices se réorganisent suite à l'amputation d'une jambe36. Cependant, l'impact de l'amputation sur les circuits de contrôle des membres reste inexploré car la découverte de ces changements nécessite l'imagerie du VNC des animaux amputés au fil des jours ou des semaines. Bien qu'en principe, on puisse plutôt regrouper les données de plusieurs animaux à des jours spécifiques après l'amputation de la jambe, cela présente deux lacunes majeures. Premièrement, la variabilité inter-animal limiterait la capacité à résoudre la dégénérescence de structures neuronales spécifiques. Deuxièmement, cette approche prendrait plus de temps, nécessitant beaucoup plus d'expériences et d'animaux par point d'intérêt. En revanche, l'imagerie longitudinale est idéale pour découvrir des changements dynamiques dans les structures neuronales en utilisant relativement peu d'animaux. Pour illustrer cette possibilité, nous avons suivi la dégradation des afférences mécanosensorielles proprioceptives primaires dans le VNC après l'amputation de la jambe. Plus précisément, nous avons visualisé les terminaisons axonales des organes chordotonaux fémoraux de la jambe proprioceptive amputée (Act88F-Rpr/+ ; iav-Gal4/UAS-GFP ; +/+) dans le neuromère T1 du VNC. Les mouches ont été implantées le premier jour post-éclosion (dpe). Puis, un jour après l'implantation (1 dpi), nous avons effectué une imagerie volumétrique à deux photons de T1. Les volumes consistaient en 100 images prises à des intervalles de profondeur de 1 μm. Ensuite, à 2 dpi, la patte avant gauche de chaque animal expérimental a été amputée près de l'articulation thorax-coxa (Fig. 3a).

a Chez les animaux de laboratoire, la jambe avant gauche a été amputée au niveau de l'articulation thorax-coxa à 2 dpi. b Schéma du système nerveux de la mouche. La région VNC imagée est mise en surbrillance (gris). Projection z de l'écart type des volumes d'imagerie confocale enregistrés à partir de mouches qui ont été (c) laissées intactes ou (d) amputées à 2 dpi (neuropil coloré nc82 souligné en gris; fluorescence GFP en noir). Des tissus ont été prélevés sur des animaux implantés dont les pattes avant gauche ont été amputées. Le tissu VNC a été retiré et coloré à 20 dpi. La pointe de flèche noire indique la région VNC présentant la plus grande différence entre l'innervation du propriocepteur intact et amputé. La barre d'échelle est de 50 μm. Projections d'intensité maximale des piles z enregistrées à partir de (e) un animal intact (contrôle) ou (f) amputé. Les données ont été acquises par microscopie à deux photons. Les images présentées sont prises à 1, 2, 4 et 15 dpi. Les images sont enregistrées sur l'image 1 dpi. La barre d'échelle est de 50 μm. Les pointes de flèches blanches indiquent la dégradation des terminaisons axonales dans le VNC des animaux amputés. g, h Fluorescence mesurée au fil des jours à l'aide de la microscopie à deux photons d'animaux intacts (n = 5 ; triangles bleus) ou amputés (n = 5 ; cercles orange-rouge). Les mesures indiquent la fluorescence moyenne dans la région d'intérêt (ROI) (g) cyan ou (h) violette comme dans les panneaux e et f, normalisée et divisée par la fluorescence moyenne à 1 dpi. Les boîtes à moustaches indiquent la médiane, les premier et troisième quartiles. Comparaisons statistiques réalisées avec un test U de Mann–Whitney (bilatéral) pour lequel un astérisque (*) indique P < 0,05 et deux astérisques (**) indiquent P < 0,01. Pour le panel g, P = 0,006 (jour 4) ; 0,006 (jour 5); 0,009 (jour 6); 0,006 (jour 7); 0,018 (jour 8); 0,009 (jour 9); 0,006 (jour 10); 0,006 (jour 11); 0,009 (jour 12); 0,006 (jour 13); 0,006 (jour 14); 0,006 (jour 15). Pour le panel h, P = 0,03 (jour 4) ; 0,006 (jour 5); 0,009 (jour 6); 0,006 (jour 7); 0,009 (jour 8); 0,009 (jour 9); 0,006 (jour 10); 0,006 (jour 11); 0,009 (jour 12); 0,006 (jour 13); 0,006 (jour 14); 0,006 (jour 15). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Les mouches implantées ont toléré l'amputation des pattes et généré des comportements normaux avec les cinq pattes restantes (comme dans la réf. 36). Chaque jour pendant 15 jours, nous avons collecté des volumes d'images T1 (Fig. 3b) d'animaux témoins ("Intact") et d'animaux dont les pattes avant gauche ont été retirées ("Amputated"). Nous avons effectué une dissection, une coloration et une imagerie confocale du VNC 18 jours après le retrait de la jambe pour confirmer que l'innervation mécanosensorielle du neuromère T1 du VNC persistait chez les animaux intacts (Fig. 3c) mais se dégradait chez les animaux amputés (Fig. 3d). Un examen attentif des volumes d'image au microscope à deux photons a révélé que, chez les animaux témoins, un photoblanchiment s'est produit dans la région d'imagerie au fil des jours (Fig. 3e). Cependant, cette baisse de fluorescence n'était pas aussi profonde que la réduction du signal observée dans les terminaisons axonales des organes chordotonaux du neuropile T1 gauche des animaux amputés (Fig. 3f; Fig. 12 supplémentaire et Film supplémentaire 9). En quantifiant les changements d'intensité du signal dans des régions d'intérêt spécifiques (ROI) de l'innervation des axones chordotonaux dans le VNC 37, nous avons mesuré une réduction de fluorescence hautement reproductible et significative chez les animaux amputés par rapport aux animaux intacts (Mann–Whitney U Test, * indique P < 0,05 et ** indique P < 0,01) (Fig. 3g, h).

En plus d'être morphologiquement adaptables au fil des jours et des semaines, les circuits neuronaux modulent également en continu leur dynamique sur des échelles de temps plus courtes en fonction de l'état interne d'un animal. Chez la drosophile, comme chez les vertébrés, ces états comprennent la faim38, la fatigue39, l'excitation sexuelle40, l'agressivité41 et l'excitation défensive42. Les états internes peuvent également changer suite à l'ingestion de substances psychoactives dont la caféine43,44,45. La surveillance continue du système nerveux est cruciale pour découvrir comment les circuits se reconfigurent au cours de ces états changeants.

Notre technique précédente pour étudier la dynamique neurale VNC chez les animaux en comportement23 nécessitait l'élimination de grandes sections d'intestin, réduisant la longévité des animaux et rendant impossibles les enregistrements à long terme qui capturent les changements d'états internes. De plus, bien que les réponses gustatives puissent être étudiées dans le cerveau46, l'ablation de l'intestin empêche l'alimentation et, par conséquent, ne permet pas d'étudier comment la satiété ou l'ingestion de substances psychoactives modulent la dynamique neuronale dans le VNC. Notre boîte à outils d'imagerie à long terme préserve l'intestin, permettant aux animaux d'être nourris pendant la microscopie à deux photons. Par conséquent, nous avons ensuite demandé dans quelle mesure nos technologies pourraient être utilisées pour découvrir l'impact de l'ingestion de médicaments sur la dynamique neuronale.

Les mouches exposées à de faibles doses de caféine ont un sommeil réduit43,44 et une activité locomotrice accrue45. Ici, nous avons demandé dans quelle mesure l'ingestion de caféine pourrait également entraîner des changements globaux dans la dynamique des populations neuronales. Pour tester cela, nous avons d'abord affamé les animaux pendant 21 à 23 h pour les encourager à se nourrir. Ensuite, après l'implantation, nous avons enregistré l'activité neurale dans le conjonctif cervical ("Avant l'alimentation"). Tout en continuant à enregistrer l'activité neurale, les animaux ont ensuite été nourris (Fig. 4a) soit avec une solution de contrôle (« saccharose uniquement ») contenant 8 mg/ml de saccharose et 1 mg de colorant amarante (pour confirmer l'alimentation47) (film supplémentaire 10), soit un solution expérimentale qui contenait également 8 mg/ml ou 40 mg/ml de caféine : « Faible caféine » (Film supplémentaire 11) ou « Élevée en caféine » (Film supplémentaire 12), respectivement. Nous avons continué à enregistrer l'activité et le comportement neuronaux pendant les 38 minutes suivantes. L'alimentation a été confirmée par une évaluation post-hoc de la coloration abdominale due à l'ingestion de colorant (Fig. 4b). Lors de l'imagerie, nous avons examiné l'activité des neurones ascendants et descendants dont les axones traversent le conjonctif cervical reliant le cerveau et le VNC. Pour ce faire, nous avons réalisé une imagerie à deux photons en coupe coronale du conjonctif cervical thoracique (Fig. 4c)23 chez des mouches exprimant l'indicateur de calcium génétiquement codé, GCaMP6f, ainsi que le marqueur anatomique, tdTomato, dans tout le système nerveux ( Act88F-Rpr/+ ; GMR57C10-Gal4/UAS-opGCaMP6f ; UAS-tdTomato/+). Pour surmonter la déformation et la traduction de l'image survenant lors des comportements des animaux, nous avons enregistré des données d'imagerie à l'aide d'un algorithme basé sur le flux optique (voir Méthodes)23. Après enregistrement de l'image, nos données d'imagerie coronale révèlent l'activité des axones appartenant aux neurones descendants qui pilotent les actions48,49 et aux neurones ascendants qui transmettent les états comportementaux en cours au cerveau50. Ces axones apparaissent sous forme d'ellipses dans nos images de microscopie à deux photons (Fig. 4d, pointes de flèches blanches). Ces régions d'intérêt (ROI) panneuronales sont cohérentes avec celles que nous avons observées lors de l'imagerie de l'activité neuronale dans des ensembles très clairsemés de neurones descendants23 et ascendants50. Ceci est le plus apparent pour la paire d'axones de neurones descendants de la grande fibre géante51 qui traversent la ligne médiane dorsale du conjonctif cervical (Fig. 4d, astérisques blancs).

a Rendu numérique d'une mouche nourrie pendant que les neurones sont enregistrés à l'aide d'un microscope à deux photons. b Photo d'un animal implanté après avoir ingéré une solution de caféine à haute concentration lors d'une microscopie à deux photons. La pointe de flèche blanche indique une coloration violette de l'abdomen, confirmant la digestion d'une solution de caféine-saccharose mélangée à un colorant Amarante. c Schéma du cordon nerveux ventral indiquant la région d'imagerie dans le conjonctif du cou. d Activité neuronale moyenne codée par couleur pendant toutes les périodes non locomotrices pour une mouche avant de se nourrir (mêmes données que le panneau supérieur en f), y compris les annotations des axones individuels traversant le conjonctif du cou (têtes de flèches). Les astérisques indiquent l'emplacement des axones de fibres géantes. e Fluorescence normalisée sur tous les axones traversant le conjonctif du cou thoracique pendant des enregistrements de 4 minutes avant (bleu), pendant (vert), peu après (orange) ou longtemps après (rouge) l'alimentation. Les mouches ont été nourries avec une solution contenant uniquement du saccharose (à gauche), du saccharose et une faible dose (au milieu) ou une forte dose de caféine (à droite). f Activité neuronale moyenne codée par couleur pendant toutes les périodes non locomotrices pour une mouche avant (en haut), immédiatement après (au milieu) ou longtemps après (en bas) l'ingestion d'une solution de caféine à haute concentration. g Analyse statistique indiquant la présence de vagues d'activité. L'activité neuronale est normalisée à l'aide de paramètres calculés sur l'activité pré-alimentation (Méthodes). L'activité normalisée maximale est indiquée pour trois mouches par condition avant, pendant et après l'alimentation. L'activité maximale n'est augmentée de manière significative que > 29 min après l'alimentation avec une solution de caféine à haute concentration (tests Mann-Whitney U unilatéraux, * indique P < 0,05, P = 0,04 pour les deux * rapporté, ns indique non significatif). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. h Le conjonctif cervical chez un animal implanté est segmenté en quatre régions d'intérêt (ROI). Ceux-ci sont superposés sur une image de projection temporelle d'écart-type. i Activité neurale normalisée au pic de fluorescence pendant une vague d'activité. Les traces sont codées par couleur comme dans le panneau h. Le pic de fluorescence moyenne dans toutes les régions est centré sur 0 s. j Heure d'activité maximale par pixel. Le pic d'activité moyenne sur l'ensemble du conjonctif du cou est fixé à 0 s.

Dans les trois conditions expérimentales - avant, pendant et peu de temps après l'alimentation - nous avons observé des fluctuations de l'activité neuronale associées à des époques de marche (Fig. 4e, traces bleues, vertes et oranges; Fig. 13c supplémentaire, Fly 7 et Supplémentaire Films 10–12). Cependant, plus de 29 min après l'alimentation, nous avons observé de grandes vagues d'activité uniquement chez les mouches nourries avec la solution de caféine à haute concentration (Fig. 4e, traces rouges). Les ondes étaient beaucoup plus grandes en amplitude que les fluctuations de l'activité neuronale associées à la locomotion spontanée. Les ondes d'activité se sont propagées sur l'ensemble du conjonctif (Fig. 4f) et étaient associées à une pose globalement rigide accompagnée de micromouvements (Supplémentaire Film 13). Pour quantifier la présence et l'amplitude des ondes à différents moments et entre les conditions expérimentales, nous avons normalisé l'activité neuronale à travers le conjonctif cervical par rapport à celle observée avant l'alimentation pour chaque mouche. Nous avons ensuite calculé la fluorescence maximale normalisée (limite supérieure du centile à 99 %) pour les périodes avant, pendant et après l'alimentation. Jusqu'à ~ 29 min après l'alimentation, le niveau d'activité maximal des mouches nourries avec une forte concentration de caféine n'était pas significativement différent de celui des mouches nourries avec du saccharose ou une solution à faible teneur en caféine (tests Mann-Whitney U, P> 0, 05). En revanche, entre 29 et 38 min après l'alimentation, l'activité maximale de chaque mouche nourrie avec une solution riche en caféine était significativement plus élevée que les autres conditions (tests Mann-Whitney U, P = 0,040), en raison de la vague d'activité neuronale (Fig. .4g). L'évolution temporelle de ces ondes était également reproductible : l'activité débutait dans le conjonctif dorsalmédial (bleu), puis dorsolatéral (vert), puis ventral (orange). Les neurones de la fibre géante (rouge) 51 ont été les derniers à devenir actifs et à maintenir une activité élevée pendant de plus longues périodes (Fig. 4h – j et Supplémentaire Fig. 13d – i). Ces données illustrent que notre boîte à outils d'imagerie à long terme peut être utilisée pour étudier comment l'ingestion d'aliments ou de médicaments influence les états internes et la dynamique neuronale globale.

Ici, nous avons décrit des dispositifs microtechniques qui ouvrent l'enquête complète et longitudinale du contrôle moteur chez les animaux qui se comportent. Plus précisément, nous permettons des enregistrements à deux photons à long terme des tissus dans le thorax de la drosophile adulte, y compris les circuits prémoteurs, sensoriels et moteurs ciblant et résidant dans le VNC. Notre boîte à outils est conçue pour relever les défis uniques de l'enregistrement à long terme du VNC par opposition à des approches plus simples qui permettent des enregistrements longitudinaux des neurones dans le cerveau12,13 : il se compose (i) d'un bras micromanipulateur, (ii) d'un polymère- implant souple à base d'implant pour déplacer les organes thoraciques, (iii) une fenêtre polymère transparente numérotée qui peut être fabriquée de manière reproductible pour sceller l'ouverture thoracique, et (iv) une étape d'attache conforme qui permet un montage doux et répété autour du thorax des animaux pour l'imagerie à deux photons. Ensemble, ces outils étendent la fenêtre temporelle d'enregistrement neuronal de seulement quelques heures23 à plus d'un mois, sans réduire sensiblement la durée de vie des animaux implantés ni perturber significativement leur comportement locomoteur. Nous avons illustré plusieurs cas d'utilisation pour notre approche d'imagerie à long terme, y compris (i) des enregistrements de plusieurs semaines de la morphologie neuronale, de l'activité pan-neuronale et de l'activité neuronale clairsemée, (ii) une dégradation de plusieurs semaines des projections des neurones sensoriels des membres vers le VNC d'un membre amputé, et (iii) des modifications globales de l'activité neuronale suite à l'ingestion de médicaments.

Nos expériences de longévité ont confirmé que la durée de vie des mouches implantées était similaire à celle des animaux intacts. Les courbes de survie ont cependant été décalées pour les mouches implantées et simulées en raison d'une surmortalité dans les premiers jours suivant la chirurgie. Cela suggère que ces pertes initiales pourraient être dues à la manipulation chirurgicale et non spécifiquement liées à l'implantation. Conformément à cela, nos études sur la marche arrière n'ont révélé aucun changement clair dans les paramètres locomoteurs entre les animaux témoins et implantés. Cependant, à l'avenir, il serait important de confirmer l'impact minimal de l'implantation sur des comportements plus complexes comme la parade nuptiale et le franchissement des écarts.

Dans une première étude de cas de notre boîte à outils, nous avons étudié la dégradation anatomique des projections chordotonales vers le VNC pendant deux semaines après l'amputation de la jambe. Nous y avons observé une dégradation marquée des terminaisons neuronales mécanosensorielles dans la première semaine suivant l'amputation. L'évolution dans le temps de cette dégradation était hétérogène à travers les retours sur investissement, compatible avec l'existence de populations distinctes de cellules chordotonales 37 qui peuvent avoir des niveaux variables de robustesse à la dégradation. Alternativement, certains terminaux peuvent survenir via des projections ascendantes de T2 (jambe médiane) ou T3 (jambe arrière) et ne sont donc pas directement affectés par l'amputation de la patte antérieure. La drosophile a déjà été utilisée dans de nombreuses études comme modèle de lésion nerveuse52, où il a été démontré que la dégradation axonale suite à une blessure peut être similaire à la dégénérescence wallérienne chez les mammifères53. Ainsi, notre boîte à outils d'imagerie à long terme pourrait à l'avenir être utilisée pour tester des interventions pharmacologiques qui peuvent ralentir ou prévenir la dégénérescence axonale induite par des blessures dans les circuits moteurs.

Lors de l'analyse de l'activité des neurones descendants et ascendants dans le conjonctif cervical thoracique après l'ingestion de caféine, nous n'avons pas observé de changements importants dans l'activité neuronale dans l'état de caféine à faible concentration, malgré les changements de comportement précédemment signalés45. D'autre part, nous avons observé de grandes vagues d'activité neuronale suite à l'ingestion d'une solution de caféine à haute concentration. Certaines mouches avaient plusieurs de ces ondes, suggérant qu'elles ne sont pas dues à la libération de calcium d'un processus de mort cellulaire terminal. Cependant, l'origine de ces dynamiques calciques reste incertaine. Par exemple, il a été démontré que la caféine induisait la libération cytoplasmique des réserves internes de Ca2+54. Bien que cela puisse être peu probable dans le cas de l'ingestion de caféine, la question de savoir si des ondes d'activité se propageant dans le temps résultent d'un tel mécanisme ou d'un déclenchement neuronal profond reste incertaine et pourrait faire l'objet d'études futures utilisant ces outils. Notamment, nous avons observé que les animaux ne récupéraient pas après s'être nourris de notre solution de caféine à haute concentration. Néanmoins, cette preuve de concept illustre comment l'imagerie à long terme chez la drosophile peut être utilisée à l'avenir pour dépister l'impact de l'ingestion de médicaments sur la dynamique neuronale chez les animaux qui se comportent.

Sur la base de ces études de cas réussies, nous envisageons que nos dispositifs d'imagerie à long terme de micro-ingénierie peuvent être mis à profit pour étudier une variété de questions et de défis supplémentaires. Par exemple, on pourrait appliquer ces appareils pour enregistrer la progression de la mort cellulaire dans des modèles de drosophile de troubles neuronaux comme la maladie de Parkinson55. Notre pipeline de fabrication d'implants est également généralisable. Par conséquent, les formes d'implants pourraient être adaptées pour relever d'autres défis expérimentaux, notamment le ciblage des circuits des ganglions abdominaux qui régulent la réceptivité à l'accouplement chez les femelles56. En outre, les implants peuvent être modifiés pour stocker et libérer des composants actifs qui, par exemple, délivrent des composés dans l'hémolymphe de manière contrôlée. Enfin, des mesures supplémentaires pourraient être prises pour automatiser l'implantation, par exemple en ouvrant la cuticule thoracique à l'aide d'un laser excimère UV57 ou en développant des techniques de manipulation robotique pour déplacer automatiquement les organes thoraciques, positionner l'implant et sceller le trou thoracique avec une fenêtre58.

En résumé, les développements technologiques présentés dans ce travail permettent une variété d'expériences sur des mouches individuelles à travers une large gamme d'échelles de temps, ouvrant une compréhension de la façon dont les systèmes biologiques - en particulier les circuits prémoteurs et moteurs - changent au cours du vieillissement ou de la progression de la maladie, suivant blessure, apprentissage ou expériences sociales, en réponse à des changements d'état interne, ou à la suite de l'ingestion d'aliments ou de médicaments. Ces données, à leur tour, peuvent inspirer le développement de contrôleurs plus adaptatifs pour les systèmes artificiels qui ont la capacité de changer de forme et de fonction pour s'adapter aux capacités et aux besoins en constante évolution.

Des fenêtres thoraciques (disques polymères transparents) ont été fabriquées par photolithographie59. Toutes les étapes d'exposition ont été effectuées sur un aligneur de masque (MJB4, Süss MicroTec, Allemagne) en utilisant un éclairage i-line. Les masques chromés ont été fabriqués à l'aide d'un graveur laser direct (VPG-200, Heidelberg Instruments, Allemagne) et d'un processeur de masque automatique (HMR900, HamaTech, Allemagne). Les dimensions des structures microfabriquées ont été mesurées à l'aide d'un microscope optique (DM8000 M, Leica Microsystems, Suisse) ou d'un profileur de surface mécanique (Dektak XT, Bruker Corporation, USA). Le protocole a commencé par traiter la surface d'une plaquette de silicium de 4 pouces avec un décapant au plasma (PVA TePla 300, PVA AG, Allemagne) à 500 W pendant 7 min pour réduire sa mouillabilité. Une solution aqueuse de 20 % (wt/vol) Dextran (MP Biomedicals, MW 60k–90k g/mol) a été centrifugée à 1000 tr/min (WS-650-23, Laurell Technologies Corporation, USA) et cuite à 150 °C pendant 2 min pour former une couche sacrificielle hydrosoluble de 1 μm d'épaisseur. Cette couche permet de libérer doucement les fenêtres à la fin du processus de fabrication (Fig. 1a-i supplémentaire). Une résine photosensible négative (SU-8 3025, Kayaku Advanced Materials, États-Unis) a été directement enduite par centrifugation sur la couche sacrificielle et cuite au four (Fig. 1a-ii supplémentaire). Notamment, à cette épaisseur, le SU-8 a une transmittance supérieure à 95 %60 (https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/07/KAM-SU-8-3000-Datasheet-7.10-final .pdf). Après exposition, les fenêtres ont été post-cuites et la résine non durcie a été retirée avec un révélateur (acétate d'éther méthylique de propylène glycol (PGMEA, acétate de 1-méthoxy-2-propanol), Sigma-Aldrich, Allemagne) (Fig. 1a-iii supplémentaire) . Ensuite, la plaquette avec des fenêtres SU-8 a été recouverte d'une couche de résine photosensible positive de 20 μm d'épaisseur (AZ 40XT) à l'aide d'un système de traitement automatisé (ACS200 Gen3, Süss MicroTec, Allemagne). Cette couche supplémentaire de polymère sert de masque physique pendant le processus de dépôt de métal. Un deuxième masque chromé a été fabriqué pour modeler des identifiants uniques sur les fenêtres à l'aide de la photolithographie. Ensuite, la plaquette a été recouverte de films de Ti et d'Au par dépôt physique en phase vapeur (EVA 760, Alliance-Concept, France) à une épaisseur de 3 nm et 15 nm, respectivement (Fig. 1a-iv supplémentaire). Le développement de la résine photosensible négative (Remover 1165, Kayaku Adv. Mat., USA) a supprimé toutes les couches au-dessus des fenêtres à l'exception des chiffres qui servent de marqueurs. Enfin, les fenêtres étiquetées ont été libérées en dissolvant la couche sacrificielle dans de l'eau DI (Fig. 1a-vi supplémentaire). Les fenêtres ont été filtrées, séchées à température ambiante et stérilisées avant d'être utilisées dans des expériences. Les fenêtres résultantes étaient optiquement transparentes (Fig. 1b supplémentaire) et de la taille appropriée pour sceller les ouvertures thoraciques (Fig. 1c supplémentaire).

Nous avons développé une technique de microfabrication à deux niveaux pour maximiser le débit, protéger les moules maîtres d'une utilisation excessive et faciliter la diffusion de la technologie62,63. En bref, les implants ont été coulés dans des gabarits en élastomère qui ont été fabriqués à partir d'une plaquette gravée servant de moule principal. Tout d'abord, une plaquette de test de silicium de quatre pouces (100/P/SS/01-100, Siegert Wafer, Allemagne) a été traitée avec de l'hexaméthyldisilazane (HMDS) (numéro CAS : 999-97-3, Sigma-Aldrich, Allemagne) et déshydratée à 125 °C pour améliorer l'adhérence à sa surface. La plaquette a ensuite été revêtue par centrifugation d'un film de photorésist positif de 8 µm d'épaisseur (AZ 9260, Microchemicals GmbH, Allemagne) à l'aide d'un système de traitement de résine automatique (EVG 150, EV Group, Allemagne) (Fig. 3a-i supplémentaire). Après les étapes de cuisson, d'exposition et de développement, la plaquette a ensuite été traitée à l'aide d'une gravure ionique réactive profonde (DRIE), en particulier un procédé Bosch, 64 (AMS 200 SE, Alcatel) pour obtenir des parois presque verticales avec un rapport d'aspect élevé (Fig. 3a-ii). La réserve positive restante a été éliminée dans un dissolvant (Remover 1165, Kayaku Advanced Materials, États-Unis) à 70 ° C et nettoyée par rinçage à l'eau et séchage à l'air (Fig. 3a-iii supplémentaire). Les gabarits en élastomère ont été fabriqués par moulage de répliques à l'aide de polydiméthylsiloxane (PDMS). Le processus de moulage de la réplique a commencé par un dépôt en phase vapeur de silane (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) Silane, Sigma-Aldrich, Allemagne) sur la surface du moule maître dans une chambre à vide pendant 6 h. La silanisation n'a été effectuée qu'une seule fois car elle forme une couche de silane permanente. Le PDMS a été préparé sous la forme d'un mélange (10:1, poids/poids) de l'élastomère et de l'agent de durcissement (numéro GMID : 01673921, Dow Europe GmbH, Allemagne) et versé sur la plaquette dans une boîte de Pétri. Pour libérer toutes les bulles piégées à l'intérieur des puits à rapport d'aspect élevé, le moule a été dégazé à l'aide d'une pompe à vide (EV-A01-7, Swiss Vacuum Technologies SA, Suisse) dans un dessiccateur à vide (F42020-0000, SP Bel-Art Labware & Apparatus , ETATS-UNIS). Enfin, l'élastomère a été durci à 65 ° C pendant 5 h dans un four (UF30, Memmert GmbH, Allemagne) et la dalle de PDMS a été décollée (Fig. 3b supplémentaire). En utilisant des marqueurs d'alignement comme guide, la dalle a ensuite été découpée en plusieurs morceaux avec une lame de rasoir pour servir de gabarits avec lesquels on pouvait ensuite fabriquer des implants (Fig. 3c supplémentaire).

Des implants flexibles ont été fabriqués à partir d'un polymère photodurcissable (Ostemer 220, Mercene Labs AB, Suède). La polymérisation se produit lorsqu'un mélange de deux composants (partie A et partie B) est exposé à la lumière UV (Fig. Supplémentaire 4a-i). La matrice PDMS a été silanisée (trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane, Sigma-Aldrich, Allemagne) pendant 1 h dans un dessiccateur sous vide (Fig. 4a-ii supplémentaire). La partie A a été chauffée à 48°C pendant une nuit pour s'assurer qu'il ne restait pas de cristaux non dissous dans la solution. La partie B et le récipient ont également été chauffés jusqu'à 48 °C avant le mélange. Les parties A et B ont ensuite été soigneusement mélangées et le mélange a été dégazé dans une chambre à vide pendant 5 minutes. Une goutte de 200 μL du mélange (1,86: 1, poids \ poids) a été versée sur le gabarit (Fig. 4a-iv supplémentaire) et le gabarit a été mécaniquement pris en sandwich entre deux lames de verre à l'aide de deux clips. La lame de verre touchant le polymère de l'implant a été préalablement traitée au plasma (PDC-32G, Harrick Plasma, USA) à 29 W pendant 1 min pour faciliter la libération de l'implant en améliorant l'adhérence entre le verre et les implants. La solution a été exposée à la lumière UV (365 nm, UV9W-21, Lightning Enterprises, USA) pendant 10 min pour la polymérisation (Fig. 4a-v supplémentaire). Les échantillons ont été tournés plusieurs fois pendant l'exposition aux UV pour assurer une réaction homogène dans toute la matrice. Les implants ont été libérés en agitant mécaniquement les matrices dans de l'alcool isopropylique (IPA) à l'aide d'un sonicateur (DT 100 H, Bandelin Sonorex Digitec, Allemagne) (Fig. 4a-vi supplémentaires). L'ensemble de ce processus a donné une plaquette avec 100 implants (Fig. 4b, c supplémentaires) qui ont ensuite été découpés à l'aide d'une lame de rasoir avant l'implantation.

Nous avons conçu et construit un bras manipulateur pour déplacer temporairement les organes thoraciques lors de l'implantation (Fig. 5a, b supplémentaires). Pour construire le bras, nous avons d'abord imprimé en 3D un moule qui nous permettait de coller une broche de dissection (26002-10, Fine Science Tools, Allemagne) à l'extrémité d'une aiguille de seringue (15391557, Fisher Scientific, USA) de manière reproductible ( Fig. 5c supplémentaire). La broche est insérée dans l'aiguille jusqu'à ce que sa pointe touche l'extrémité du moule. Nous avons collé la broche à l'aiguille à l'aide d'un adhésif durcissable aux UV (Bondic, Aurora, ON Canada). Le bras a ensuite été plié à l'aide d'une pince et guidé par un deuxième moule imprimé en 3D (Fig. 5d supplémentaire). La goupille a d'abord été pliée grossièrement puis ajustée plus finement à l'aide du moule imprimé en 3D. Une autre pièce imprimée en 3D a ensuite été utilisée pour connecter l'aiguille de la seringue à un micromanipulateur à 3 axes (DT12XYZ, ThorLabs, USA) et à un étage d'extension (Fig. 5a supplémentaire). L'ensemble de la structure a ensuite été attaché à une planche à pain (MB1224, ThorLabs, USA) (Fig. 5b supplémentaire).

Nous avons utilisé l'écriture laser directe65 pour fabriquer un mécanisme conforme personnalisé qui maintient les mouches en place pendant la microscopie à deux photons. Le mécanisme a été conçu à l'aide d'un logiciel de CAO 3D (SolidWorks 2021, Dassault Systèmes, France). Une plaquette de silicium découpée en dés de 25 mm × 25 mm a été utilisée comme substrat sur lequel les structures ont été imprimées. La surface du substrat a été traitée au plasma à 500 W pendant 7 min et recouverte d'une solution aqueuse de 10 % (wt/vol) Poly(acrylic acid) (MW 50000, Polysciences, USA) à 2000 tr/min pendant 15 s à l'aide d'un spin -coater (WS-650-23, Laurell Technologies Corporation, USA) (Fig. 6a-i-iii supplémentaire). Le mécanisme a été fabriqué à l'aide d'un graveur laser direct (Photonic Professional GT +, Nanoscribe GmbH, Allemagne) qui contrôle la polymérisation à deux photons (Fig. 6a-iv supplémentaires). Un polymère (IP-S, Nanoscribe GmbH, Allemagne) a été choisi comme matériau d'impression en raison de son module de Young de 4,6 GPa66 et de la résolution à laquelle les structures pouvaient être imprimées. La conception globale a été segmentée en plusieurs images car la zone de balayage laser maximale fournie par un objectif 25 × (NA 0,8, Zeiss) est de 400 μm. Cette approche se traduit par une impression fine sur une mise en page relativement grande. L'objectif a été plongé dans une résine photosensible liquide pendant l'impression. À la fin du processus d'impression, le polymère non durci a été éliminé à l'aide d'un développeur (PGMEA, Sigma-Aldrich, Allemagne) pendant 20 minutes (Fig. 6a-v supplémentaires). Enfin, le PGMEA a été rincé à l'aide d'IPA. Le mécanisme a été libéré du substrat en dissolvant la couche sacrificielle dans de l'eau DI (Fig. 6a-vi supplémentaire). Cela a donné une structure microfabriquée suffisamment grande pour contenir le thorax de la mouche (Fig. 6b, c supplémentaires). L'étape de remontage a été complétée en fixant le mécanisme sur un cadre en aluminium découpé au laser à l'aide de colle durcissable aux UV (Bondic, Aurora, ON Canada).

Les matériaux et équipements nécessaires à la fabrication de nos dispositifs microtechniques sont résumés dans les tableaux supplémentaires 2 et 3.

Les étapes nécessaires pour préparer les mouches pour l'imagerie VNC à long terme sont décrites ici (Fig. 1e, les organes internes ont été esquissés à l'aide des données de la réf. 67). Voir Film supplémentaire 2 pour plus de détails.

Une mouche a été anesthésiée à froid pendant 5 min. Ensuite, il a été positionné sur la face inférieure d'une étape de dissection et ses ailes ont été retirées près de leur base à l'aide de forceps. Le thorax a ensuite été pressé à travers un trou (Etchit, Buffalo, MN) dans la cale en acier de la platine (McMaster-Carr, USA ; acier inoxydable 0,001", type 316 recuit doux ; pièce n° 2317K11). Ensuite, la platine a été retournée. et une petite goutte de colle durcissable aux UV (Bondic, Aurora, ON Canada) a été placée sur le scutellum, pour fixer la mouche en place.

La scène a été remplie de solution saline (tableau supplémentaire 1). Une aiguille de seringue de 30 G a ensuite été utilisée pour couper un petit trou rectangulaire (plus petit que la fenêtre de 600 μm de diamètre) dans la cuticule thoracique dorsale. Le trou a été fait en insérant l'aiguille dans le thorax postérieur près du scutellum. Ensuite, trois lignes ont été coupées dans le thorax latéral et antérieur. Une dernière ligne a été découpée pour compléter une ouverture rectangulaire. Le morceau de cuticule résultant a ensuite été retiré à l'aide d'une pince.

Les IFM dégradés résiduels ont été retirés du thorax ouvert à l'aide d'une pince. Ensuite, une aiguille en verre tirée (P-1000, Sutter instrument, USA) (30-0018, Harvard Apparatus, USA) a été utilisée pour détacher de petits liens trachéaux entre un gros morceau de trachée et le côté gauche de l'intestin. La glande salivaire gauche a ensuite été également retirée à l'aide d'une pince.

Le bras manipulateur était positionné sur le dessus de la scène avec sa pointe visible. L'étape de dissection a été positionnée avec la tête de la mouche pointant vers l'expérimentateur. La pointe du bras a ensuite été insérée dans le thorax à l'aide d'un manipulateur à 3 axes (DT12XYZ, ThorLabs, USA). La pointe du bras a ensuite été insérée sur le côté droit (de l'expérimentateur) de l'intestin près du milieu du proventricule. La pointe a été insérée suffisamment profondément pour être sous le jabot et les glandes salivaires, mais sans toucher le VNC. Une fois que le bout du bras était sur le côté droit de la glande salivaire, du jabot et de l'intestin, il était tiré vers le côté gauche de la cavité thoracique, créant un espace pour l'implant fermé.

Une fois que les organes des mouches ont été solidement maintenus sur le côté gauche de la cavité thoracique par le bras de manipulation, l'implant a été fermé dans l'air à l'aide d'une pince puis transféré dans la solution saline remplissant l'étape de dissection. L'implant fermé a ensuite été positionné devant la mouche sur la scène. Une paire de pinces plus fines a ensuite été utilisée pour insérer l'implant dans le thorax de l'animal. Enfin, une aiguille de verre a été utilisée pour ajuster l'emplacement de l'implant et le maintenir à la hauteur appropriée, lui permettant de s'ouvrir passivement. Une fois ouverte, l'aiguille de verre a été utilisée pour presser doucement le côté gauche de l'implant vers le bas du thorax pendant que le bras était retiré, et pour éliminer toute bulle sur l'implant.

Une fois l'implant bien positionné, une aiguille de seringue (15391557, Fisher Scientific, USA) a été utilisée pour retirer la solution saline de la platine. Une fenêtre a ensuite été positionnée au-dessus du trou cuticulaire et centrée avec le numéro d'identification sur la partie postérieure du thorax près du scutellum. Un fil a ensuite été utilisé pour ajouter de minuscules gouttes de colle durcissable aux UV entre la fenêtre et la cuticule thoracique environnante, en commençant par le côté droit du scutellum et en terminant sur le côté gauche. Une solution saline a ensuite été rajoutée à la platine. La colle UV durcie, qui attachait auparavant la mouche à la scène, a été retirée à l'aide d'une aiguille. La solution saline a ensuite également été retirée et la fenêtre a été entièrement scellée en plaçant et en durcissant de la colle UV sur la cuticule postérieure de la mouche près du scutellum.

Une fois que le trou thoracique a été entièrement scellé par une fenêtre transparente, la mouche a été démontée de l'étape de dissection en poussant doucement l'avant du thorax à travers le trou dans la cale en acier. La mouche a ensuite été remise dans un flacon de nourriture pour récupérer.

Toutes les mouches ont été élevées avec de la nourriture standard à base de semoule de maïs selon un cycle de 12 h de lumière et 12 h d'obscurité. Les expériences pour chaque étude particulière ont été réalisées à une heure constante de la journée pour exclure la possibilité de facteurs de confusion liés au rythme circadien. Aucune approbation éthique spécifique n'était requise pour les expériences sur la drosophile. Pour la plupart des expériences, des mouches femelles ont été utilisées car elles sont de plus grande taille. Cela augmente la facilité de dissection, d'implantation et d'attache. Il facilite également le traitement informatique des images et la détection de la région neurale d'intérêt.

Des mouches femelles exprimant CsChrimson dans Moonwalker Descending Neurones (MDN)28 (UAS-CsChrimson/Act88F-Rpr ; VT50660.p65AD(attp40)/+ ; VT44845.Gal4DBD(attp2)/+) (Fig. 2) ont été implantées à cinq jours- post-éclosion (dpe). Pour cette expérience, avant l'implantation, les implants ont été plongés dans une solution de dextrane à 30 mg/ml (#31392, Sigma-Aldrich, Suisse) tout en étant mécaniquement fermés. Les implants ont ensuite été retirés de la solution et séchés à l'aide d'un Kimwipe torsadé (5511, Kimberly-Clark, USA). Cette étape a été réalisée pour fixer les implants en position fermée. Cependant, nous avons découvert plus tard que le dextran n'est pas nécessaire pour fermer les implants et nous avons supprimé cette étape. Les implants ont ensuite été positionnés dans le thorax de la mouche comme décrit ci-dessus. Le nombre de jours suivant l'implantation est noté « jours post-implantation » (dpi). Des animaux témoins d'âge et de sexe appariés ont été sélectionnés à partir du même croisement parental. Pour les études de longévité, les mouches ont été logées individuellement dans des flacons de nourriture et évaluées tous les 1 à 2 jours.

Des études de locomotion ont été réalisées à 1–3 dpi, 14–16 dpi et 28–30 dpi. Les animaux ont été individuellement anesthésiés à froid puis transférés dans des arènes carrées arrondies pour une activation optogénétique et un enregistrement vidéo. Chaque enregistrement consistait en 30 s de comportements générés spontanément (principalement la marche et le toilettage), suivis de trois périodes de 3 s de stimulation optogénétique à 590 nm (6 mW/cm2) avec des intervalles interstimulus de 10 s. Par conséquent, chaque session d'enregistrement durait 59 s.

Pour traiter les données vidéo, les centroïdes des mouches ont été suivis à l'aide d'une version personnalisée de Tracktor68. Leurs orientations ont ensuite été extraites à l'aide d'un réseau neuronal (implémenté dans PyTorch69) qui a été formé sur des données étiquetées à la main. Le réseau se composait de deux couches convolutionnelles suivies de trois couches entièrement connectées. Toutes les couches, à l'exception de la dernière, ont été suivies d'une fonction d'activation ReLU70. Nous avons également appliqué l'abandon après les deux premières couches entièrement connectées avec une probabilité de 0,271. Pour former le réseau, nous avons annoté à la main un total de 300 échantillons dans trois orientations (tête haute, tête basse et latérale). Les images en niveaux de gris ont ensuite été recadrées à l'aide des emplacements des centroïdes Tracktor et redimensionnées à 32 × 32 pixels. Pendant la formation, nous avons appliqué au hasard des transformations affines (20 degrés de rotation, 5 pixels de translation et un facteur d'échelle de 0,2), des augmentations de retournement horizontal et vertical avec une probabilité de 0,5. Nous avons utilisé le package torchvision de PyTorch pour toutes les augmentations de données. Le réseau a été entraîné avec une perte d'entropie croisée en utilisant 80 % des données. Nous avons utilisé un optimiseur Adam avec un taux d'apprentissage de 0,001, sans perte de poids ni baisse du taux d'apprentissage72. Nous nous sommes entraînés pendant 1000 époques et avons sélectionné les poids avec la meilleure erreur de test.

Les vitesses de translation ont été calculées en appliquant un filtre Savitzky–Golay du second ordre avec une dérivée du premier ordre aux positions centroïdes. Le signe des valeurs de vitesse a été défini sur négatif pour les mouvements contraires à la direction de cap de l'animal. Les mouches qui sont entrées en collision avec les murs de l'arène pendant plus de 0,3 s pendant la période de stimulation ont été exclues de l'analyse. Les mouches qui ont été retournées dorsalement (c'est-à-dire marchant sur le plafond revêtu de sigma) pendant la période de stimulation ont également été exclues de l'analyse. La métrique "Pente de réponse à la marche arrière" a été calculée comme l'accélération depuis le début de chaque période de stimulation jusqu'à la vitesse minimale (vitesse arrière maximale) atteinte sur cette période. La métrique "Distance de marche arrière parcourue" a été calculée comme la somme de Riemann gauche des courbes de vitesse au cours de chaque période de stimulation. Nous n'avons considéré que les images où la vitesse était négative. Enfin, la "Vitesse de translation négative maximale" est la valeur de vitesse minimale atteinte à chaque période de stimulation.

Pour les études sur la survie et le comportement des mâles, des animaux exprimant Reaper dans leurs muscles de vol indirect (Act88F-Rpr ; UAS-GFP ; +/+) ont été implantés 1 jour après l'éclosion (dpe). Des animaux témoins appariés selon l'âge et le sexe (« Intact ») ont été sélectionnés à partir du même croisement parental. Les mouches ont été logées individuellement dans des flacons de nourriture et retournées chaque jour dans un nouveau flacon de nourriture tout en évaluant leur longévité (Fig. 10 supplémentaire). Le comportement spontané a été enregistré pour trois mâles par groupe. Ces mâles ont été individuellement anesthésiés au froid puis transférés dans des arènes carrées arrondies pour des enregistrements vidéo. Chaque enregistrement consiste en 60 s de comportements générés spontanément.

Des mouches femelles exprimant la GFP dans tout le système nerveux (Act88F-Rpr/+ ; GMR57C10-Gal4/UAS-GFP ; +/+) (Fig. 1h) ont été implantées à 4–6 dpe et conservées individuellement dans des flacons de nourriture. À 1–3 dpi, 14–16 dpi et 28–30 dpi, les mouches ont été attachées sur une platine de remontage et 25 volumes d'imagerie de 100 μm de profondeur (1 μm de pas) ont été acquis à l'aide d'un microscope à deux photons (microscope Bergame II, ThorLabs, USA) et un laser 930 nm (MaiTai DeepSee, Newport Spectra-Physics, USA) avec 20 mW de puissance à l'emplacement de l'échantillon. Nous avons acquis 0,1 volume par seconde (vps) à l'aide d'un scanner Galvo-Resonance23. Les 25 images par profondeur ont ensuite été enregistrées les unes par rapport aux autres à l'aide du module HyperStackReg à Fidji73 et d'une transformation de corps rigide. Ces images enregistrées ont ensuite été projetées le long de l'axe du temps en une image d'écart type. Le volume résultant a ensuite été codé par couleur en profondeur à l'aide de la macro Temporal-Color de Fidji.

Pour les expériences sur des mouches mâles, nous avons imagé des animaux exprimant la GFP dans tout le système nerveux (Act88F-Rpr ; GMR57C10-Gal4/UAS-GFP ; +/+) (Fig. 10 supplémentaire). Ces animaux ont été implantés à 1 dpe et conservés individuellement dans des flacons alimentaires. À 1 dpi, 5 dpi et 10 dpi, les mouches ont été attachées et un enregistrement volumétrique du VNC a été effectué à l'aide d'un microscope à deux photons à 930 nm avec 11 mW de puissance laser. Les mouches ont été anesthésiées à l'aide de dioxyde de carbone (1,3 l/min) appliqué ventralement tout en enregistrant les volumes d'imagerie. Les volumes consistaient en des images de 512 × 512 pixels prises tous les 1 μm sur une profondeur totale de 100 μm. Des projections Z ont ensuite été générées avec un codage couleur de profondeur à l'aide de la macro "Temporal-Color" de Fidji.

Des mouches exprimant GCaMP6f et tdTomato dans tout le système nerveux (Act88F-Rpr/+ ; GMR57C10-Gal4/UAS-GCaMP6f ; UAS-tdTomato/+) ont été implantées à 5 dpe (femelle) ou 1 dpe (mâle) puis montées sur le étape d'imagerie à deux photons à 1, 5 et 10 dpi (femme, film supplémentaire 4 ; homme, film supplémentaire 5). Un plan d'imagerie horizontal du neuromère prothoracique a été acquis à l'aide d'un microscope à deux photons à 930 nm avec une puissance de 25 mW. Trois images horizontales du plan z ont été acquises à l'aide d'un scanner Galvo-Resonance et moyennées dans une image à un taux d'imagerie de 10,7 ips. Les trames de comportement ont été acquises simultanément (comme dans la réf. 23) à une cadence de 80 ips.

Une mouche femelle exprimant GCaMP6f et tdTomato dans les neurones descendants DNa0123,48 (Act88F-Rpr/+ ; GMR22C05-AD-spGal4/UAS-GCaMP6f ; GMR56G08-DBD-spGal4 / UAS-tdTomato) a été implantée à 3 dpe. La même mouche a ensuite été montée sur la platine du microscope à deux photons à 1, 3 et 5 dpi. Un plan d'imagerie horizontal du neuromère prothoracique a été acquis à l'aide d'un microscope à deux photons à 930 nm avec 28 mW de puissance laser. Les images du plan horizontal ont été acquises à l'aide d'un scanner Galvo-Galvo à un taux d'imagerie de 5,6 ips. Les trames de comportement ont été acquises simultanément (comme dans la réf. 23) à une cadence de 80 ips. AxoID a été utilisé pour détecter les neurones en tant que régions d'intérêt (ROI) dans des images au microscope à deux photons et extraire leurs valeurs de fluorescence50. Le classificateur d'événements de fluorescence neurale semi-automatisé décrit dans la réf. 50 a été utilisé pour détecter les événements d'activité neuronale à partir de traces de fluorescence. Celles-ci ont ensuite été corrélées aux rotations sphériques du tapis roulant.

Pour illustrer comment d'autres conceptions d'implants pourraient être utilisées pour obtenir un accès optique aux régions postérieures du VNC (Fig. 9 supplémentaire), une mouche femelle exprimant la GFP dans tout le système nerveux (Act88F-Rpr/+ ; GMR57C10-Gal4/UAS-GCaMP6f ; UAS-tdTomato/+) a été disséqué à 3 dpe. Une goutte de colle UV a été durcie sur la pointe d'un implant. L'implantation a également été légèrement modifiée: une fois inséré dans le thorax de la mouche, l'implant a été poussé vers l'arrière avec la colle durcie reposant contre la cuticule intérieure du scutellum, fixant l'implant en position. La braguette a ensuite été fermée à l'aide d'une fenêtre transparente. Un volume d'imagerie (576 × 576 pixels et 100 μm de profondeur) du VNC a été enregistré à l'aide d'un microscope à deux photons avec un scanner Galvo-Galvo à 930 nm avec une puissance laser de 22 mW.

Des mouches femelles exprimant la GFP dans leurs organes chordotonaux (Act88F-Rpr/+ ; iav-Gal4/UAS-GFP ; +/+) (Fig. 3) ont été implantées à 1 jpe. Une pile z du VNC a été enregistrée à 1 dpi, à l'aide d'un microscope à deux photons à 930 nm avec 55 mW de puissance laser. Les mouches ont été anesthésiées avec du dioxyde de carbone (1,8 l/min) fourni ventralement tout en enregistrant les z-stacks. Les piles Z consistaient en 576 × 384 images de pixels prises tous les 1 μm sur une profondeur totale de 100 μm (c'est-à-dire 100 images par volume). La jambe avant gauche a ensuite été retirée au niveau de l'articulation thorax-coxa à l'aide de ciseaux à dissection (#15300-00, Fine Science Tools, Allemagne). Un deuxième z-stack a ensuite été immédiatement enregistré. Les mouches ont été conservées individuellement dans des flacons de nourriture et imagées chaque jour en utilisant les mêmes paramètres d'enregistrement jusqu'à 15 dpi. L'alignement de pile linéaire de Fidji avec le plug-in d'enregistrement SIFT74 a ensuite été utilisé pour enregistrer toutes les piles z projetées dans la première pile z. Un script Python personnalisé a ensuite été utilisé pour dessiner et extraire la fluorescence moyenne de régions d'intérêt spécifiques. La fluorescence moyenne dans ces régions a été mesurée pour chaque jour et normalisée pour tous les animaux en les divisant par la fluorescence moyenne le premier jour.

Les systèmes nerveux des mouches ont été disséqués et fixés avec du paraformaldéhyde (441244, Sigma-Aldrich, USA) à 20 dpi. Les échantillons ont été colorés contre nc82 avec un anticorps primaire anti-nc82 de souris dilué à 1:20 dans une solution PBST, puis suivis d'un anticorps secondaire de chèvre anti-souris Alexa 633 conjugué dilué à 1:500 (procédure détaillée décrite dans la réf. 23). Cela nous a permis d'acquérir des images confocales qui comprenaient à la fois des repères de neuropiles et l'expression endogène de la GFP. Le logiciel Zen 2011 14.0 a été utilisé pour acquérir des images confocales. Les intensités laser confocales et les gains PMT ont été sélectionnés manuellement pour éviter la saturation des pixels. Ces piles z confocales ont ensuite été projetées en 2D à l'aide de la projection d'écart type de Fidji. La projection de l'écart type de l'expression de la GFP est représentée par une image inversée (Fig. 3c, d). Un script python personnalisé a été écrit pour détecter les limites du VNC à l'aide de la projection d'écart type des images nc82. Ce contour a été détecté à l'aide de la bibliothèque Open CV, puis dessiné sur des images de projection d'écart type GFP.

Mouches femelles (5 dpe) exprimant un indicateur de calcium, GCaMP6f, et un marqueur anatomique, tdTomato, dans tout le système nerveux (Act88F-Rpr/+ ; GMR57C10-Gal4/UAS-GCaMP6f ; UAS-tdTomato/+) (Fig. 4) ont été privés de nourriture pendant 21 à 23 h sur un Kimwipe humide (5511, Kimberly-Clark, États-Unis). Ils ont ensuite été implantés sans fenêtre thoracique, et maintenus sur la platine de dissection (la phase de remontage n'a pas été utilisée ici) pour limiter le nombre d'interventions. Les animaux ont ensuite été placés sous un microscope à deux photons où ils pouvaient marcher sur un tapis roulant sphérique constitué d'une balle en mousse à air (0,8 L/min) (Last-A-Foam FR7106, General Plastics, USA) d'un diamètre de 1 cm23. Des coupes coronales de leur conjonctif cervical ont ensuite été imagées à 930 nm avec une puissance laser de 15 mW. Nous avons atteint un taux d'imagerie de 16 images par seconde (fps) en utilisant un scanner Galvo-Resonance. En parallèle, le comportement des mouches a été enregistré à l'aide de sept caméras à 80 fps. Les rotations des billes ont également été mesurées le long de trois axes à l'aide de deux capteurs de débit optiques6,23. Nous avons enregistré l'activité et le comportement neuronaux dans des essais d'environ 4 min chacun. Dans un premier temps, quatre essais ont été enregistrés. Ensuite, la balle en mousse a été abaissée et l'enregistrement s'est poursuivi pendant que les mouches se nourrissaient d'une solution composée soit (i) de 1 ml d'eau déminéralisée, de 8 mg de saccharose (A2188.1000, Axon Lab, Suisse) et de 1 mg de colorant Amarante (A1016, Sigma-Aldrich, USA), (ii) une solution de caféine à faible concentration consistant en 1 ml d'eau déminéralisée, 8 mg de caféine (C0750, Sigma-Aldrich, USA), 8 mg de saccharose et 1 mg d'Amarante, ou (iii) une haute concentration de solution de caféine sursaturée composée de 1 ml d'eau déminéralisée, 40 mg de caféine, 8 mg de saccharose et 1 mg d'amarante. Les animaux ont été nourris à l'aide d'une aiguille en verre tirée (P-1000, Sutter instrument, USA ; paramètres de l'extracteur - Chaleur : 502 ; Traction : 30 ; Vitesse : 120 ; Temps : 200 ; Pression : 200). Une petite goutte de colle durcissable aux UV (Bondic, Aurora, ON Canada) a été ajoutée près de la pointe de l'aiguille pour empêcher la solution de remonter sur l'aiguille. L'aiguille a été positionnée devant les mouches à l'aide d'un manipulateur (uMp-3, Sensapex, Finlande). Après l'alimentation, le tapis roulant sphérique a été repositionné sous la mouche et huit autres essais d'imagerie ont été acquis.

Nous avons utilisé du code Python personnalisé, sauf indication contraire. Pour toute analyse d'image, l'axe y est ventro-dorsal le long du corps de la mouche, et l'axe x est médio-latéral. Les tailles des noyaux d'image et de filtre sont spécifiées sous la forme (y, x) en unités de pixels. Les enregistrements du conjonctif cervical thoracique souffrent de grands mouvements inter-images, y compris de grandes translations, ainsi que de plus petites déformations non affines. Parce que les indicateurs de calcium (par exemple, GCaMP6f) sont conçus pour avoir une faible fluorescence de base, ils sont difficiles à utiliser pour la correction de mouvement. Par conséquent, nous nous sommes appuyés sur les signaux de la protéine fluorescente rouge co-exprimée, tdTomato, pour enregistrer les images du canal PMT rouge (tdTomato) et vert (GCaMP6f). Tout d'abord, nous avons effectué un enregistrement du centre de masse (COM) de chaque image enregistrée pour supprimer les grandes traductions et recadré les régions d'arrière-plan autour du connecteur du cou (de 480 × 736 à 352 × 576). Ensuite, nous avons calculé le champ de mouvement de chaque image rouge par rapport à la première image enregistrée en utilisant le flux optique et corrigé les images rouges et vertes pour le mouvement en utilisant une interpolation bilinéaire. L'algorithme de correction du mouvement du flux optique a été décrit précédemment dans la réf. 23. Nous n'avons utilisé que la composante de flux optique pour calculer les champs de mouvement et omis la contrainte d'appariement des caractéristiques. Nous avons régularisé le gradient du champ de mouvement pour favoriser la douceur (λ = 800). Le code Python pour le package o ptic f low motion correction (ofco) est disponible sur https://github.com/NeLy-EPFL/ofco.

Nous avons observé que les valeurs absolues de fluorescence étaient légèrement inférieures du côté droit du conjonctif que du côté gauche, probablement en raison de la diffusion par les organes thoraciques qui sont poussés vers la droite par l'implant. Pour corriger cette fluorescence absolue inégale, nous avons calculé la moyenne de toutes les images corrigées du mouvement dans le temps. Nous avons ensuite filtré médian et filtré passe-bas l'image résultante (filtre médian : (71,91), filtre gaussien : σ = 3) pour supprimer les caractéristiques des neurones individuels et ne conserver que les changements spatiaux globaux de fluorescence. Nous avons ensuite calculé la moyenne sur l'axe y pour obtenir un profil de fluorescence sur l'axe x (gauche - droite) et ajuster une ligne droite aux 200 pixels les plus centraux. Pour corriger la diminution de la fluorescence vers le côté droit, nous avons multiplié la fluorescence par la valeur inverse de cette ligne droite ajustée au profil de l'axe des abscisses. Notez que cette correction ne fait que faciliter la visualisation de la fluorescence et n'a aucun impact sur le calcul de ΔF/F car, pour un pixel donné, la fluorescence à chaque instant et sa fluorescence de base sont multipliées par la même constante. facteur.

Pour débruiter les données enregistrées et corrigées, nous avons utilisé une version adaptée de l'algorithme DeepInterpolation75. En bref, DeepInterpolation utilise un réseau neuronal pour débruiter une image de microscopie en "l'interpolant" à partir de trames temporellement adjacentes. Un U-Net est formé de manière non supervisée en utilisant 30 trames (environ 2 s) avant et 30 trames après la trame cible en entrée et la trame actuelle en sortie. Ainsi, le bruit indépendant est supprimé de l'image et les composants qui évoluent dynamiquement dans le temps sont conservés. Nous avons modifié la procédure de formation pour adapter un lot dans les 11 Go de RAM d'une carte graphique Nvidia GTX 2080TI : plutôt que d'utiliser l'intégralité du cadre (352 × 576 pixels), nous avons utilisé un sous-ensemble de l'image (352 × 288 pixels) pendant la formation. Nous avons choisi au hasard la coordonnée x du sous-ensemble. Lors de l'inférence, nous avons utilisé l'image entière. Nous avons vérifié que l'utilisation de différentes tailles d'images pendant la formation et l'inférence ne modifiait pas l'image débruitée résultante en dehors des régions frontalières. Nous avons formé un modèle pour chaque mouche en utilisant 2000 cadres sélectionnés au hasard dans l'un des essais avant de l'alimenter et l'avons appliqué à tous les cadres suivants. Les paramètres de formation sont décrits dans le tableau 1. L'algorithme DeepInterpolation adapté peut être trouvé sur la branche "adapttoR57C10" du référentiel GitHub suivant : https://github.com/NeLy-EPFL/deepinterpolation

Nous montrons les valeurs de fluorescence comme ΔF/F (Films supplémentaires 10–12). Cela a été calculé comme \({{\Delta }}F/F=\frac{F-{F}_{0}}{{F}_{0}}\), où F est la fluorescence variant dans le temps et F0 est la ligne de base de fluorescence par pixel. Pour calculer F0, nous avons appliqué un filtre gaussien spatial (σ = 10) aux images et convolué chaque pixel avec une fenêtre temporelle de 10 échantillons (environ 0,6 s). Nous avons ensuite identifié la fluorescence minimale de chaque pixel dans tous les essais.

Des capteurs de débit optiques ont été utilisés pour mesurer les rotations sphériques du tapis roulant6,23, mais ils sont intrinsèquement bruyants. Par conséquent, nous avons calculé la moyenne mobile sur 80 échantillons (environ 200 ms). À partir des valeurs de capteur prétraitées, nous avons calculé les vitesses avant, latérales et de virage6. Nous avons classé les périodes stationnaires (aucun mouvement de la balle) comme des périodes où les valeurs absolues du flux optique des vitesses de rotation sphériques du tapis roulant étaient inférieures à un seuil de \(0,31 {{{{{{{{\rm{ms}}}}}} }}}^{-1}\widehat{=}0,01\) rotations/s et au moins 75 % des images dans le temps ± 0,5 s de l'échantillon étaient en dessous de ce seuil. Ce dernier critère garantissait que de courtes périodes stationnaires entre les périodes de marche seraient exclues.

Nous avons enregistré trois modalités de données différentes à trois fréquences d'échantillonnage différentes : les données d'imagerie à deux photons ont été enregistrées à ~ 16 Hz, les images comportementales de sept caméras ont été acquises à 80 Hz et les mouvements de balle à l'aide de deux capteurs de flux optiques ont été mesurés à près de 400 Hz. Par conséquent, pour synchroniser ces mesures pour une analyse plus approfondie, nous avons sous-échantillonné toutes les mesures à la fréquence d'images d'imagerie à deux photons en faisant la moyenne de tous les échantillons de comportement et de rotation de balle acquis au cours d'une image à deux photons.

Pour calculer les traces de fluorescence normalisées pour chaque essai, comme le montre la figure 4e, nous avons moyenné la fluorescence sur l'ensemble du conjonctif cervical et calculé le centile à 99 % de cette série chronologique au cours des essais avant l'alimentation. Nous avons ensuite normalisé la série chronologique de tous les essais enregistrés à partir de cette mouche au centile de pré-alimentation à 99 %. Pour effectuer une analyse statistique, nous avons utilisé la fluorescence normalisée et calculé le maximum (limite supérieure du centile à 99 %) dans certaines périodes de temps avant, pendant et après l'alimentation. Avant l'alimentation, la fluorescence normalisée maximale est l'unité pour chacune des 9 mouches, comme prévu à partir de la normalisation centile. Pour les périodes pendant, <9 min après, <19 min après, <29 min après et <38 min après l'alimentation, nous avons effectué des tests Mann-Whitney U pour déterminer si l'activité neuronale maximale après une ingestion élevée de caféine était significativement différente de l'activité maximale. activité après saccharose ou faible ingestion de caféine (Fig. 4g). Dans le but d'appliquer le moins de quantité ou de prétraitement nécessaire, jusqu'à présent, nous avons utilisé des données de fluorescence qui n'ont pas été débruitées à l'aide de DeepInterpolation. Cependant, dans ce cas, pour analyser le timing précis des vagues, nous avons appliqué DeepInterpolation comme décrit ci-dessus. Cela réduit la fluorescence de fond et le bruit à haute fréquence. Pour analyser la progression temporelle des ondes de fluorescence, nous avons d'abord identifié le moment du pic de fluorescence sur l'ensemble du Tpeak conjonctif cervical. Tous les temps sont donnés par rapport au temps de ce pic permettant une analyse précise des différences temporelles. Nous avons ensuite calculé la fluorescence moyenne dans le temps dans des régions d'intérêt sélectionnées manuellement (conjonctif dorsal, latéral et ventral, ainsi que des neurones à fibres géantes) et les avons représentées normalisées à leurs valeurs minimales et maximales. Nous avons lissé la série temporelle avec un filtre gaussien (\(\sigma=3\widehat{=}0,18\) s). Pour identifier le temps de pointe pour chaque pixel, nous avons appliqué un filtre gaussien temporel (\(\sigma=10\widehat{=}0,62\) s) et un filtre gaussien spatial (σ = 1) et avons recherché la valeur de fluorescence maximale dans Tpeak ± 10 s. Sur la figure 4f, nous montrons la fluorescence moyenne pendant les périodes où la mouche était stationnaire (c'est-à-dire sans déplacer la balle).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données brutes générées dans cette étude ont été déposées sur un référentiel public disponible à : https://dataverse.harvard.edu/dataverse/long_term_imaging_vnc_drosophila. Les données sources sont fournies avec ce document.

Des codes personnalisés utilisés pour analyser les données brutes sont disponibles sur : https://github.com/NeLy-EPFL/Long-Term-Imaging-VNC-Drosophilahttps://doi.org/10.5281/zenodo.6826488.

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Nous remercions Alain Herzog pour les photos et vidéos d'animaux implantés. LH reconnaît le soutien d'une subvention EU H2020 Marie Skłodowska-Curie (754354). JB reconnaît le soutien d'une bourse de doctorat du Boehringer Ingelheim Fonds. VLR reconnaît le soutien du Conseil national mexicain pour la science et la technologie, CONACYT, sous le numéro de subvention 709993. SG reconnaît le soutien d'une subvention EPFL SV iPhD. La FA reconnaît le soutien d'une bourse de doctorat du Boehringer Ingelheim Fonds. MSS reconnaît le soutien du Conseil européen de la recherche (ERC) dans le cadre du programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne (accord de subvention n° 714609). PR reconnaît le soutien d'un subside Projet FNS (175667) et d'un subside SNSF Eccellenza (181239).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Laura Hermans, Murat Kaynak.

Laboratoire de neuroingénierie, Brain Mind Institute & Institute of Bioengineering, EPFL, Lausanne, Suisse

Laura Hermans, Jonas Braun, Victor Lobato Rios, Chin-Lin Chen, Adam Friedberg, Semih Günel, Florian Aymanns & Pavan Ramdya

Laboratoire de systèmes microbiorobotiques, Institut de génie mécanique et Institut de bioingénierie, EPFL, Lausanne, Suisse

Laura Hermans, Murat Kaynak et Mahmut Selman Sakar

Laboratoire de vision par ordinateur, EPFL, Lausanne, Suisse

Semih Gunel

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LH - Conceptualisation, Méthodologie, Logiciel, Validation, Analyse formelle, Enquête, Acquisition de données, Conservation des données, Rédaction - Préparation du projet original, Rédaction - Révision et édition, Visualisation. MK - Méthodologie, Logiciel, Validation, Analyse formelle, Rédaction - Préparation du projet original, Rédaction - Révision et édition, Visualisation. JB - Méthodologie, Logiciel, Analyse formelle, Conservation des données, Rédaction - Révision et édition, Visualisation. VLR - Méthodologie, Logiciel, Analyse formelle, Conservation des données, Rédaction - Révision et édition, Visualisation. C.-LC - Acquisition de données, Curation de données, Rédaction - Révision et édition AF - Méthodologie, Rédaction - Révision et édition SG - Méthodologie, Logiciel, Curation de données, Rédaction - Révision et édition. FA - Méthodologie, logiciel, rédaction - révision et édition. MSS - Conceptualisation, Méthodologie, Ressources, Rédaction - Préparation du projet original, Rédaction - Révision et édition, Supervision, Administration de projet, Acquisition de financement. RP - Conceptualisation, Méthodologie, Ressources, Rédaction - Préparation du projet original, Rédaction - Révision et édition, Supervision, Administration du projet, Acquisition de financement.

Correspondance à Mahmut Selman Sakar ou Pavan Ramdya.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Davide Raccuglia et les autres évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail.

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Réimpressions et autorisations

Hermans, L., Kaynak, M., Braun, J. et al. Des dispositifs microtechniques permettent une imagerie à long terme du cordon nerveux ventral chez la drosophile adulte qui se comporte. Nat Commun 13, 5006 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32571-y

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Reçu : 13 novembre 2021

Accepté : 04 août 2022

Publié: 25 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-32571-y

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